1. 蛋白沉淀 蛋白能溶于水是因?yàn)槠浔砻嬗杏H水性氨基酸，在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)處若溶液的離子強(qiáng)度特別高或者特別低，蛋白則傾向于從溶液中析出。硫 酸銨是沉淀蛋白zui常用的鹽，因?yàn)樗诶涞木彌_液中溶解性好，冷的緩沖液有利于保持目的蛋白的活性。硫 酸銨分餾常用作試驗(yàn)室蛋白純化的*步，它可以初步粗提蛋白質(zhì)，去除非蛋白成分。蛋白質(zhì)在硫 酸銨沉淀中較穩(wěn)定，可以短期在這種狀態(tài)下保存中間產(chǎn)物，當(dāng)前蛋白質(zhì)純化多采用這種辦法進(jìn)行粗分離翻。在規(guī)模化生產(chǎn)上硫 酸銨沉淀方法仍存在一些問題，硫 酸銨對不銹鋼器具的腐蝕性很強(qiáng)。其他的鹽如硫 酸鈉不存在這種問題，但其純化效果不如硫 酸銨。除了鹽析外蛋白還可以用多聚物如PEG和防凍劑沉淀出來，PEG是一種惰性物質(zhì)，同硫 酸銨一樣對蛋白有穩(wěn)定效果，在緩慢攪拌下逐漸提高冷的蛋白溶液中的PEG濃度，蛋白沉淀可通過離心或過濾獲得，蛋白可在這種狀態(tài)下長期保存而不損壞。蛋白沉淀對蛋白純化來說并不是多么好的方法，因?yàn)樗荒苓_(dá)到幾倍的純化效果，而我們在達(dá)到目的前需要上千倍的純化。其好處是可以把蛋白從混雜有蛋白酶和其他有害雜質(zhì)的培養(yǎng)基及細(xì)胞裂解物中解脫出來。
2. 緩沖液的更換 雖然更換緩沖液不能提高蛋白純度，但它卻在蛋白純化方案中起著極其重要的作用。不同的蛋白純化方法需要不同pH及不同離子強(qiáng)度的緩沖液。假如你用硫 酸銨將蛋白沉淀出來，毫無疑問蛋白是處在高鹽環(huán)境中，需要想辦法脫鹽，可用的方法有利用半透膜透析，通過勤換透析液體去除鹽分，此法尚可，但需幾個小時，通常要過夜，也難以用予大規(guī)模純化中。新型的設(shè)備將透析膜夾在兩個板中間，板的一側(cè)加緩沖液，另一側(cè)加需脫鹽的蛋白溶液，并在蛋白溶液一側(cè)通過泵加壓，可以使兩側(cè)溶液在數(shù)小時內(nèi)達(dá)到平衡，若增加對蛋白溶液的壓力，還可迫使水分和鹽更多通過透析膜進(jìn)入透析液達(dá)到對蛋白濃縮的目的。也有出售的脫鹽柱，柱內(nèi)的填料是小孔徑的顆粒，蛋白分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，先于高濃度鹽離子從柱中流出，從而使二者分離。蛋白純化的每一步都會造成目的蛋白的丟失，緩沖液平衡的步驟尤甚。蛋白會結(jié)合在任何它能接觸的表面上，剪切力、起泡沫和離子強(qiáng)度的快速變化很容易讓蛋白失活。
3.離子交換色譜 這是在所有的蛋白純化與濃縮方法中zui有效方法。基于蛋白與離子交換樹脂間的相互電荷作用，通過選擇不同的緩沖液，同一種蛋白既可以和陰離子交換樹脂(能結(jié)合帶負(fù)電荷的分子)結(jié)合，也可以和陽離子交換樹脂結(jié)合。樹脂所用的帶電基團(tuán)有四種：二乙基氨基乙基用于弱的陰離子交換樹脂；羧甲基用于弱的陽離子交換樹脂；季銨用于強(qiáng)陰離子交換樹脂；甲基磺酸酯用于強(qiáng)陽離子交換樹脂。蛋白質(zhì)由氨基酸組成，氨基酸在不同的pH環(huán)境中所帶總電荷不同。大多數(shù)蛋白在生理pH(pH6～8)下帶負(fù)電荷，需用陰離子交換柱純化，的pH下蛋白會變性失活.應(yīng)盡量避免。由于在某個特定的pH下不同的蛋白所帶電荷數(shù)不同，與樹脂的結(jié)合力也不同，隨著緩沖液中鹽濃度的增加或pH的變化，蛋白按結(jié)合力的強(qiáng)弱被依次洗脫。在工業(yè)化生產(chǎn)中更多地是改變鹽濃度而不是去改變pH值，因?yàn)榍罢吒菀卓刂啤Ｔ趯?shí)驗(yàn)室中幾乎總是用鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入柱的緩沖液中鹽濃度平穩(wěn)地上升，當(dāng)離子強(qiáng)度能夠中和蛋白的電荷時，蛋白就被從柱上洗脫下來。但在工業(yè)生產(chǎn)中鹽濃度很難控制，所以常用分步洗脫而不足連續(xù)升高的鹽梯度。與排阻層析相比，離子交換特異性更好，有更多的參數(shù)可以調(diào)整以獲得*的純化效果，樹脂也比較便宜。值得一提的是，即便是用zui控制的條件，僅用離子交換單一的方法也得不到純的蛋白，還需要其他的純化步驟。
4. 親和層析 親和層析基于目的蛋白與固相化的配基特異結(jié)合而滯留，其他雜蛋白會流過柱子。本方法存在的問題是：單抗非常昂貴，而且也需先純化；單抗與目的蛋白結(jié)合力太強(qiáng).要用苛刻的條件來洗脫，這會使目的蛋白失活并破壞單抗；混合物中的其他蛋白如蛋白酶也可能破壞抗體或與它們非特異結(jié)合；某些單抗也會在純化過程中從樹脂上解離下來混入產(chǎn)物中，也需要從終產(chǎn)物中去除。親和柱通常在純化過程的后期應(yīng)用，此時標(biāo)本體積已縮小，大部分的雜質(zhì)已經(jīng)去除。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase，GST)是zui常用的親和層析純化標(biāo)簽之一，帶有此標(biāo)簽的重組蛋白可用交聯(lián)谷胱甘肽的層析介質(zhì)純化，但本方法有以下缺點(diǎn)：首先，蛋白上的GST必須能合適地折疊，形成與谷胱甘肽結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)才能用此方法純化；其次，GST標(biāo)簽多達(dá)220個氨基酸，如此大的標(biāo)簽可能會影響表達(dá)蛋白的可溶性，使形成包涵體，這會破壞蛋白的天然結(jié)構(gòu)，難于進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，有時即便純化后再酶切去除GST標(biāo)簽也不一定能解決問題。另一種可應(yīng)用的親和純化標(biāo)簽是6組氨酸標(biāo)簽，組氨酸的咪唑側(cè)鏈可親和結(jié)合鎳、鋅和鈷等金屬離子，在中性和弱堿性條件下帶組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白與鎳柱結(jié)合，在低pH下用咪唑競爭洗脫。組氨酸標(biāo)簽與GST相比有許多優(yōu)點(diǎn)，首先，由于只有6個氨基酸，分子量很小，一般需要酶切去除：其次，可以在變性條件下純化蛋白，在高濃度的尿素和胍中仍能保持結(jié)合力；另外6組氨酸標(biāo)簽無免疫原性，重組蛋白可直接用來注射動物，也不影響免疫學(xué)分析。雖然有這么多的優(yōu)點(diǎn)，但此標(biāo)簽仍有不足，如目的蛋白易形成包涵體、難以溶解、穩(wěn)定性差及錯誤折疊等。鎳柱純化時金屬鎳離子容易脫落漏出混入蛋白溶液，不但會通過氧化破壞目的蛋白的氨基酸側(cè)鏈，而且柱子也會非特異吸附蛋白質(zhì)，影響純化效果。若目的蛋白可與某種碳水化合物特異結(jié)合，或者需要某種特殊的輔因子，可將該碳水化合物或輔因子固相化制成親和柱，結(jié)合后目的蛋白可用高濃度的碳水化合物或輔因子洗脫。
5. 疏水作用 層析蛋白是由疏水性和親水性氨基酸組成的。疏水性氨基酸位于蛋白空間結(jié)構(gòu)的中心部位，遠(yuǎn)離表面的水分子。親水性氨基酸殘基則位于蛋白表面。由于親水性氨基酸吸引了許多的水分子，所以通常情況下整個蛋白分子被水分子包圍著，疏水性氨基酸不會暴露在外。在高鹽濃度的環(huán)境中蛋白的疏水性區(qū)域則會暴露并與疏水性介質(zhì)表面的疏水性配基結(jié)合。不同的蛋白疏水性不同，與疏水作用力大小也不同，通過逐漸降低緩沖液中鹽濃度沖洗柱子，在鹽濃度很低時，蛋白恢復(fù)自然狀態(tài)，疏水作用力減弱被洗脫出來。
疏水性樹脂的選擇性是由疏水性配基的結(jié)構(gòu)決定的，常用的直鏈配體為烷基配體(alkyl ligands)和芳基配體(arylligands)，鏈越長結(jié)合蛋白的能力也越強(qiáng)。理想樹脂種類的選擇應(yīng)根據(jù)目的蛋白的化學(xué)性質(zhì)而定，不能選擇結(jié)合力太強(qiáng)的樹脂，結(jié)合力太強(qiáng)的樹脂會很難洗脫，所以開始時應(yīng)選用中等結(jié)合力的苯基樹脂探討條件。為了使選擇合適的介質(zhì)更容易，Amersham Biosciences推出了疏水作用樹脂選擇試劑盒，里面包括5種不同的樹脂供比較。疏水層析很適合作為離子交換純化的下一個步驟，因?yàn)槭杷饔脤游鲈诟啕}濃度下上樣，從離子交換得到的產(chǎn)物不需更換緩沖液即可使用。蛋白又在低鹽緩沖液中洗脫，又省去了下一步純化前的更換緩沖液的步驟，既節(jié)約了時間，又減少了蛋白的丟失。
6. 排阻層析 也叫凝膠過濾或分子篩。排阻層析柱的填充顆粒是多孔的介質(zhì)，柱中圍繞著顆粒所能容納的液體量叫流動相，也稱無效體積。太大的蛋白不能進(jìn)入顆粒的孔內(nèi)，只能存在于無效體積的溶液中，將會zui早從柱中洗脫出來，對這部分蛋白無純化效果。由于各種蛋白的分子大小不同，擴(kuò)散進(jìn)入特定大小孔徑顆粒內(nèi)的能力也各異。大的蛋白分子會被先洗脫出來，分子越小，洗脫出來的越晚。為得到*的純化效果，應(yīng)將孔徑大小選在目的蛋白能在無效體積和總柱床體積的中點(diǎn)附近洗脫。排阻層析有其他方法所不具備的優(yōu)點(diǎn)，首先所能純化的蛋白分子量范圍寬，Tosoh Biosep公司的聚合物樹脂，排阻極限可達(dá)200000kD；其次，樹脂微孔的形狀適合分離球形的蛋白質(zhì)，純化過程中也不需要能引起蛋白變性的有機(jī)溶劑。應(yīng)該注意的是某些蛋白不適合用凝膠過濾純化，因?yàn)楸炯夹g(shù)所用樹脂有輕度的親水性，電荷密度較高的蛋白容易吸附在上面。排阻層析從不用于純化過程的早期，因?yàn)檫@種方法要求標(biāo)本高度濃縮，上樣量只能在柱體積的1％～4％之間，柱子要細(xì)而長才能得到好的分離效果，樹脂本身也比較昂貴，規(guī)模化的工業(yè)生產(chǎn)中不太適用。
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